Desde su nacimiento, fue apodada como "la Beltraneja", debido a los rumores y a las dudas de que fuera realmente hija del rey Enrique. Este era conocido como "el impotente". Su primer matrimonio fue anulado por no haber sido consumado, y era un rumor muy extendido (pero nunca provado), de que su hija Juana había sido realmente engendrada por su caballero favorito, Beltrán de la Cueva.
La infancia de Juana fue muy ajetreada y algo cruel, pues siendo una niña fue usada por unos y otros para sus propósitos. Recién nacida, fue jurada en cortes como princesa de asturias y por tanto, heredera. En aquellos años, el rey tenía profundas disputas con la nobleza castellana. En 1464 ya le quitaron la herencia al trono, otorgándosela al infante Alfonso, hermano del rey, que moriría poco después.
La pequeña Juana vivió tiempo fuera de la corte, custodiada por algunos de los nobles cercanos al rey, como Pacheco, el Marqués de Villena. Tras interminables desavenencias entre el rey Enrique y su hermana Isabel, en 1968 firman los Pactos de Guisando, por los cuales Enrique vuelve a desheredar a su hija Juana en favor de su hermana, futura Isabel la Católica, a la que declara heredera del trono. Hacen todo lo posible por encontrar un esposo notable para Juana, le proponen al Duque de Guyena, hermano del rey francés, pero este acaba muriendo enfermo antes de que se pactase nada.
En 1474 muere Enrique IV. Isabel, haciendo cumplir lo pactado, se proclama reina. Pero el entorno de Juana reclama su derecho al trono, en su legitimidad como hija del rey. Así pues, en la ciudad de Plasencia, el 25 de mayo de 1475 acaban casando a Juana de tan solo 13 años, con Alfonso V, el rey de Portugal. De este modo da comienzo una larga guerra de sucesión entre 2 matrimonios: el compuesto por Juana y Alfonso, reyes de Castilla y Portugal, y el compuesto por Isabel y Fernando, reyes de Castilla y Aragón.
El bando de Juana, pese a que contó desde el principio con más apoyos nobles, auspiciados por los infatigables nobles Pacheco el marqués y Alfonso Carrillo, arzobispo de Toledo. Sin embargo la guerra, desarrollada principalmente en las zonas fronterizas del Tajo y Duero entre Castilla y Portugal (Extremadura, Zamora, Toro, etc.) acaba decantándose hacia el bando isabelino.
Escudo usado por el bando de la unión dinástica de Castilla-Portugal
El final decisivo tuvo lugar el día en que el Papa Sixto IV toma partido por Isabel. Este toma la decisión de anular la bula por la cual consintió el matrimonio entre Alfonso y Juana, sobrina suya. Así pues, matrimonio anulado, Alfonso perdía sus legítimas pretensiones sobre Castilla, siendo esto la puntilla que acaba minando al bando de Juana, que acaba derrotado. En 1479 firman el Tratado de Alcazovas, donde se fijan las condiciones de paz, así como el destino de Juana, que tendría que renunciar de por vida a sus derechos dinásticos.
Finalizada la guerra, una Juana aun con 17 años, se ve humillada y desposeída de todos sus derechos reales y privilegios. En Portugal le dan el trato de Excelente Señora, pero el tratado de paz, la fuerza a ingresar interna en el Monasterio de Santa Clara, en Coimbra. Durante su internamiento, hubieron algunas polémicas. El nuevo rey portugués la prometió con el heredero de Navarra, para provocar un conflicto con Castilla que no llegó a mayores por la muerte del prometido. Se dice, desconociendo la certeza, que enviudado Fernando el Católico, propuso matrimonio a Juana para conservar su derecho sobre Castilla frente a su yerno, Felipe el Hermoso, algo que esta rechazó.
Juana finalmente vivió su madurez sin contraer matrimonio, residiendo en el Castillo de San Jorge en Lisboa, y hasta el fin de sus días, el 12 de abril de 1530, siguió considerándose legítima reina de Castilla, título que acabó legando, (sin validez legal pues no poseía), al rey de Portugal.
